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        LncRNAs對卵泡發育不同階段的影響

        來源:生殖醫學雜志 作者:陳亞楠,李瑞梅,陳曉麗
        發布于:2020-12-25 共8108字

          摘    要: 長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一類長度大于200個核苷酸的RNA,沒有編碼蛋白質的功能,但是可以調控基因表達,并且參與細胞內多種生物功能的調控過程。目前的研究認為,LncRNAs可能通過調節卵丘的擴張和卵母細胞的成熟參與到卵泡發育的過程。因此,對LncRNAs和卵泡發育關系的深入研究有助于進一步了解卵泡發育的分子機制。現就LncRNAs在卵泡發育過程中的作用進行總結。

          關鍵詞: 長鏈非編碼RNA; 卵母細胞; 卵泡發育;

          Abstract: Long non-coding RNAs(LncRNAs) are a type of RNA with a length greater than 200 nucleotides. It does not have the function of encoding proteins,but it can regulate gene expression and participate in the regulation process of various biological functions in cells. Current studies believe that LncRNAs may participate in follicle development by regulating cumulus expansion and oocyte maturation. In-depth study on the relationship between LncRNAs and follicle development will help to further understand the molecular mechanism of follicular development. The role of LncRNAs in follicle development is reviewed in this paper.

          Keyword: Long non-coding RNAs; Oocyte; Follicular development (J Reprod Med 2020,29(12):1677-1681);

          長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一類長度大于200個核苷酸且無編碼蛋白質功能的RNA。近年來,越來越多的研究表明,LncRNAs幾乎在基因表達的每一個階段都發揮了廣泛的調節作用,這些調節作用包括信號轉導、誘導分化等[1]。目前許多證據顯示了LncRNAs在人類各種疾病中的重要性,并指出它們的失調和突變是一些疾病的基礎[2]。LncRNAs不僅在感染、腫瘤和細胞凋亡等生物過程中起調控作用[3,4,5,6],而且具有作為治療靶點和診斷標記物的潛力[7,8],且其在卵泡成熟、胚胎發育等生殖過程中的作用也在不斷地被發現[9,10,11]。目前,已確定了大量與生殖相關的LncRNAs。Karlic等[12]使用二代測序和從頭轉錄組裝技術定義了由卵母細胞向胚胎轉變過程(OET)中表達的1 600個LncRNAs的核心群體,解釋了OET中已分化的配子轉變為多能卵裂球及母體-受精卵RNA交換過程中涉及到的LncRNAs重塑。而卵泡發育過程本質上就是卵母細胞和周圍的顆粒細胞及卵泡膜細胞相互之間的調控,LncRNAs可能參與其中。本文就LncRNAs對卵泡發育過程中不同階段的影響進行了總結,為進一步研究LncRNAs在輔助生殖技術中的機制和作用提供理論基礎。
         

        LncRNAs對卵泡發育不同階段的影響
         

          一、LncRNAs影響生殖干細胞的增殖和發育

          Li等[13]通過高通量測序研究了雄性和雌性小鼠生殖干細胞中mRNAs、LncRNAs和CircRNAs的表達譜,發現了18 573個新的LncRNAs和18 822個新的CircRNAs,并通過實時定量PCR進一步證實了這些新的LncRNAs和CircRNAs的存在,并且有8 115個mRNAs、3 996個LncRNAs和921個CircRNAs存在性別差異性表達,此研究還發現LncRNA Gm11851、LncRNA Gm12840、LncRNA 4930405O2 2Rik和LncRNA Atp10d等在小鼠生殖干細胞中存在性別差異,這表明LncRNAs可能參與生殖干細胞的調控及發育過程。

          哺乳動物基因組轉錄的LncRNA生長停滯特異性轉錄本5(Gas5)在多種發育過程中起著重要的調控作用。Wang等[14]研究發現LncRNA Gas5在新生小鼠卵巢中高表達,并且定位于雌性生殖系干細胞(FGSCs)和卵母細胞,可促進FGSCs增殖、延長FGSCs在體外存活的時間、抑制體外培養中FGSCs的凋亡。所以我們可以認為LncRNA Gas5可能參與調控FGSCs生長及其向卵母細胞發育的過程。

          Penkala等[15]從X染色體中鑒定出一個新的LncRNA,命名為LncRHOXF1,是一種長約1kb的剪接多聚腺苷酸,存在于體外分化的人滋養外胚祖細胞的胞核和胞漿中,在人類囊胚的滋養外胚層和原始內胚層細胞中大量表達,在缺乏LncRHOXF1 的人類胚胎干細胞中進行的功能獲得性實驗結果表明,LncRHOXF1抑制了胚胎干細胞增殖,而有利于其細胞的分化。

          二、LncRNAs調節卵丘擴張和發育

          卵丘細胞(CCs)在位置上比壁層顆粒細胞更靠近卵母細胞,對卵母細胞的成熟有極其重要的作用,主要體現在CCs參與了阻滯卵母細胞減數分裂、誘導卵母細胞減數分裂過程的恢復、支持卵母細胞質的成熟等過程[16]。并且有研究發現,CCs對卵母細胞和卵泡發育的同步性是至關重要的[17]。

          Bouckenheimer等[11]利用轉錄組測序技術分析發現人卵母細胞周圍的CCs可為卵母細胞運輸大量的營養物質,包括 mRNA和LncRNAs,說明LncRNAs 可以通過CCs影響卵母細胞的成熟。后來Yerushalmi等[18]從體外成熟(IVM)患者的生發泡期卵丘-卵母細胞復合體(COCs)中獲得致密型的CCs,從試管受精(IVF)/卵胞漿內單精子注射(ICSI)患者的中期(MII)COCs中獲得擴張型的CCs,通過使用RNA測序技術獲得樣本的整體轉錄組圖譜,從致密型和擴張型CCs中發現的差異表達基因多達1 746個,且大多與細胞增殖、細胞運動、細胞周期、細胞間信號傳導和相互作用、細胞外基質和類固醇合成有關。差異表達的基因中包含89個LncRNAs,其中12個LncRNAs編碼在已知的參與顆粒細胞生長發育進程的基因的內含子中,這表明LncRNAs可能參與卵丘擴張和卵母細胞成熟的調節。

          Xu等[19]比較了3對可形成高質量胚胎的成熟卵母細胞的CCs(H-CCs)和可導致低質量胚胎的成熟卵母細胞的CCs(P-CCs)中LncRNA的表達譜,共有20 563個LncRNAs在人CCs中表達,與H-CCs比較,P-CCs中有124個LncRNAs持續上調,509個LncRNAs持續下調(折疊變化≥2.0,P<0.05),LncRNAs在P-CCs和H-CCs中的表達存在差異,提示LncRNAs可能通過調節卵丘細胞來參與卵母細胞的發育過程。

          多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女無排卵性不孕的最常見原因之一,Huang等[20]首次用基因芯片技術確定了PCOS患者CCs的全基因組LncRNAs。研究者使用微陣列描述了10名志愿者(5名PCOS患者和5名正常女性)的CCs中的LncRNAs圖譜,觀察到623個LncRNAs和260個mRNAs表達顯著上調或下調(≥2倍變化),選取其中5個差異表達的LncRNAs(XLOC_011402、ENST00000432431、ENST00000433673、ENST00000450294和ENST00000454271)進行實時定量PCR驗證,結果與基因芯片結果一致。進一步的分析結果表明2號染色體轉錄了大量的差異表達的LncRNAs,有作為增強子來調節其鄰近蛋白編碼基因的可能性。這些結果表明,與正常婦女相比,PCOS患者CCs中的LncRNAs表達異常,這些差異可以用來區分PCOS患者和正常婦女的CCs。提示LncRNAs會影響卵母細胞的發育。

          三、LncRNA參與顆粒細胞增殖、分化與凋亡

          卵巢中的顆粒細胞(GC)的重要性不言而喻,從原始卵泡生長啟動到增殖、分化,再到閉鎖/排卵,直至最終黃體形成整個過程中,既有卵母細胞對GC增殖與分化的調控,也有GC對卵母細胞成熟的影響。

          抗苗勒管激素(AMH)對以下細胞有作用:成年動物的卵巢顆粒細胞、睪丸間質細胞及睪丸支持細胞。AMH通過其AMH Ⅱ型受體(Amhr2)實現其特異性的作用,但目前研究尚未明晰Amhr2基因被特異性激活機制。Kimura等[21]在睪丸支持細胞與卵巢顆粒細胞中發現了一個從Amhr2基因上游轉錄而來的LncRNA,LncRNA-Amhr2,分析得出LncRNA-Amhr2激活可提高Amhr2啟動子活性。在小鼠顆粒細胞OV3121細胞中,Tet-on系統誘導的 LncRNA-Amhr2轉錄可顯著提高Amhr2啟動子的活性。以上研究可知,通過增強啟動子活性,LncRNA-Amhr2在卵巢顆粒細胞Amhr2基因的激活中發揮作用。

          脯氨酰寡肽酶(POP)是一種多功能蛋白酶,參與多種生理活動,為了鑒定POP基因新的調控元件,Matsubara等[22]比較了人類和小鼠POP基因的序列,在基因間隔區相鄰處找到了6個保守非編碼序列(CNS),有4個LncRNAs是從位于小鼠POP基因的CNS轉錄的,其中一個LncRNA(LncPrep+96kb)的表達模式與POP基因的表達模式相關。研究者在原代卵巢GC和肝細胞系中將LncPrep+96kb敲除,這兩種細胞中POP的mRNA表達水平都降低了,但過表達LncPrep+96kb,只增加GC中POP mRNA的表達。由于LncPrep+96kb在激素處理的卵巢中上調的時間與POP的時間相同,說明LncPrep+96kb可能在GC的POP基因激活中發揮作用。

          Liu等[23]研究了LncRNAs在PCOS發病機制中的潛在作用。通過微陣列比較了7名PCOS患者和7名正常女性GC中的LncRNAs表達譜,采用實時定量PCR檢測了53例PCOS患者和50例對照組GC中LncRNA HCG26的表達水平,并敲除了KGN細胞中的HCG26基因,觀察其對細胞增殖、芳香化酶和卵泡刺激素受體基因表達以及雌二醇產生的影響。與對照組相比,PCOS患者 GC中共有862個LncRNAs轉錄本和998個信使RNA轉錄本差異表達(P<0.05)。PCOS患者HCG26水平升高,并與竇卵泡計數相關。KGN細胞敲除了HCG26基因后,細胞增殖和細胞周期進程受到抑制,芳香化酶基因的表達和雌二醇的產生增加,提示失調的LncRNAs可能在GC增殖和類固醇生成中起重要作用。

          卵巢早衰(POF)是一種典型的老年女性生殖系統病理性疾病。感染、炎癥、免疫異常、基因突變、放療和化療均可引起POF。卵巢顆粒細胞(OGC)功能障礙直接影響卵巢早衰的發生。Liu等[24]發現雷公藤多甙可通過促進p53磷酸化和激活絲氨酸/蘇氨酸激酶11-p53-p21信號通路誘導大鼠卵巢早衰。Xiong等[25]進行的一項體內實驗發現環磷酰胺可導致小鼠卵巢萎縮、抑制OGC增殖。環磷酰胺處理組的p53、p66Shc和p16的蛋白表達水平顯著增高。Northern blot雜交結果顯示,環磷酰胺處理組的LncRNA-Meg3雜交信號強度顯著高于對照組。芯片結果證實,經環磷酰胺處理的OGC的 p66Shc啟動子DNA片段顯著增加,且富含p53蛋白。這個實驗說明,環磷酰胺可以通過激活LncRNA-Meg3-p53-p66Shc通路促進卵巢早衰、抑制OGCs增殖,也說明可能存在LncRNAs對GC內部調控的機制。

          四、LncRNAs調控卵母細胞核與細胞質的成熟

          卵母細胞成熟過程包括細胞核與細胞質的成熟。細胞核成熟包括染色體復制過程、生發泡破裂過程、同源染色體分離過程等。而細胞質的成熟又分為細胞器的形態成熟過程、卵母細胞骨架成熟過程以及成熟過程中需要的RNA轉錄與蛋白質合成等。付蕾等[26]的研究表明卵母細胞成熟率低可能影響受精及胚胎發育,導致可供移植的胚胎數減少,妊娠率下降。

          Huang等[27]通過實時定量PCR方法檢測卵丘細胞中PWRN2的表達水平,以確定其在PCOS患者的卵母細胞核成熟過程中的潛在作用。發現在PCOS患者的卵母細胞成熟過程中,LncRNA PWNR2通過減少miR-92b-3p與TMEM120B靶結合的可能性,進而在PCOS患者的卵母細胞核成熟過程中發揮重要作用。

          Karlic等[12]研究發現,LncRNAs對卵母細胞的成熟過程產生了非常大的影響,當mRNA在卵母細胞內發揮轉錄功能、調控細胞質聚腺苷酸化時,卵母細胞內處于休眠狀態的LncRNAs會被激活,在促進細胞質聚腺苷酸化的過程中與mRNA起到協同作用,所以LncRNAs在調控卵母細胞成熟特別是胞質成熟過程中可能會發揮重要的作用。Bouckenheimer等[11]對公開的RNA測序數據進行了分析,發現在中期(MII)卵母細胞和CCs中有豐富的LncRNAs,例如:C3orf56、BCAR4、Tunar、OOEP-AS1、CASC18和LINC01118存在于MII卵母細胞,MALAT1、NEAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1和VIM-AS1存在于CCs。該研究還發現MII卵母細胞中的LncRNAs可能參與了染色質重塑和胞質成熟。

          五、LncRNAs參與排卵和黃體形成

          Neat1是一種長鏈非編碼RNA,它是paraspeckles核體的架構組件之一。研究發現,排卵正常的小鼠在Neat1基因敲除后不能懷孕,而且Neat1在黃體中高表達,近一半的Neat1基因敲除小鼠黃體組織的形成嚴重受損,說明Neat1對于黃體的形成至關重要[28]。

          李加宇等[29]研究找到了3個在小鼠卵巢中具有相對特異性高表達的LncRNAs(LncRNA147、LncRNA274和LncRNA647),而且LncRNA647、LncRNA147和LncRNA274在不同卵巢狀態下的表達豐度存在差異。分別檢測了這3個LncRNAs在小鼠不同發育時期和不同發情時期卵巢中的表達水平,不同發育期分別是5日齡、3周齡、5周齡、8周齡,不同的發情時期包括發情間期、發情前期、發情期和發情后期。結果顯示LncRNA147和LncRNA 274在8周齡小鼠卵巢中的表達水平達到最高,在其它3個發育階段卵巢中的表達水平由5日齡、5周齡和3周齡依次遞減;LncRNA647較高表達水平出現在5周齡和8周齡卵巢中,5日齡和3周齡卵巢中的表達水平依次降低;在不同發情時期的卵巢中,3個LncRNAs的表達水平均按發情間期、發情前期、發情期和發情后期的順序逐漸升高,而發情后期的表達水平顯著高于其它3個發情時期。體內轉染LncRNA274基因后,與對照組相比較,卵泡發育相關基因LHR升高了約18倍,FSHR的表達水平升高了約7倍,BMP-15升高了約7.5倍,EGFR升高了約7.5倍,GDF-9升高了約11倍;黃體的數量(13.3±4.9)顯著增加(P<0.05),而腔前卵泡、有腔卵泡數量沒有顯著變化。構建LncRNA274轉基因小鼠并進行表型分析,發現小鼠產仔數顯著增加,結果具有統計學意義。上述結果表明LncRNAs可促進黃體形成和排卵。

          六、LncRNA與卵巢發育

          β晶體蛋白B2(CRYBB2)基因敲除小鼠的卵巢出現形態和功能異常。Gao等[30]對野生型和CRYBB2基因敲除小鼠的卵巢組織進行了LncRNA和mRNA微陣列分析。野生型和CRYBB2基因敲除小鼠卵巢組織間有157個差異表達的LncRNAs和1 085個差異表達的mRNAs。實時定量PCR證實,在CRYBB2基因敲除小鼠的卵巢組織中,LncRNA A-30-P010 19163的表達下調,配體門控離子通道7(P2rx7)的表達相應下調。綜上所述,CRYBB2調控不同的LncRNAs的表達,從而影響卵巢的發育,LncRNA A-30-P01019163可能通過調節卵巢P2rx7的表達而影響卵巢發育。

          研究卵母細胞質量的重要意義之一是提高卵母細胞體外成熟的臨床效果,所有提高卵母細胞質量的方法都能用于提高臨床體外成熟卵母細胞的妊娠率,進而為不孕癥的治療帶來新的可能性。現在科學研究在不斷探索和發現LncRNAs的作用及機制,在卵泡發育、卵母細胞成熟以及早期胚胎發育過程之中,已經有研究成果逐步證實了LncRNAs的調控功能。希望在不遠的將來,可以通過檢測LncRNAs直接預測卵母細胞的成熟狀態,從而為卵子受精和胚胎發育提供更有力的技術支持,推進生殖技術的進一步發展。

          參考文獻

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        作者單位:濟寧醫學院臨床醫學院 濟寧醫學院附屬醫院
        原文出處:陳亞楠,李瑞梅,陳曉麗,李澤武,代會穎,韓瀟,顧玉婷,楊愛軍.長鏈非編碼RNA與卵泡發育相關性的研究進展[J].生殖醫學雜志,2020,29(12):1677-1681.
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